Purity por HPLC en péptidos

Metodología HPLC

Cómo se mide la purity de un péptido, paso a paso. Protocolo de fase reversa basado en directrices USP y adaptado a péptidos sintéticos.

• Preparación de muestra — Disolución en fase móvil con filtración a 0.22 μm para eliminar partículas que interfieran con la lectura cromatográfica.
• Separación cromatográfica — Columna C18 de fase reversa (250 × 4.6 mm, 5 μm). Gradiente acetonitrilo/agua con TFA 0.1 %. Flujo 1.0 mL/min.
• Detección UV a 220 nm — Longitud de onda optimizada para el enlace peptídico. Inyección de 20 μL con detector de arreglo de diodos (DAD).
• Cálculo de purity — Normalización de área: % purity = (área del pico principal / área total) × 100. Se reportan todas las impuritys > 0.1 %.

¿Qué mide la HPLC?

La HPLC separa los componentes de una muestra según su afinidad por las fases estacionaria y móvil. El área del pico principal frente al área total de picos determina el porcentaje de purity del péptido: cuanto mayor es ese porcentaje, menor es la proporción de impuritys o fragmentos de síntesis.

Verificación cruzada con espectrometría de masas

La HPLC cuantifica la purity; la espectrometría de masas (MS) confirma que la masa molecular medida corresponde a la del péptido esperado. Ambas técnicas juntas validan identidad y purity, no solo una de las dos.